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动物组织基因组DNA提取试剂盒使用说明
点击次数:2544 发布日期:2018-4-16  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

动物组织基因组DNA提取试剂盒

一、 

    动物组织基因组DNA提取试剂盒(DePure Tissue DNA Kit)适用于动物组织、培养细胞、抗凝血液、体液、分泌液等生物样品的DNA提取。试剂盒基于硅胶柱纯化技术,提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提,也无需进行耗时的醇类沉淀,整个提取过程只需30分钟(不含消化时间)。动物组织基因组DNA提取试剂盒一次可处理1~20mg组织样品、1~200µl抗凝血液或体液样品、5 x 106个培养细胞,得到的DNA可直接用于PCR、Southern blot、LAMP、Real-Time PCR等下游实验。

 

二、 

    动物组织基因组DNA提取试剂盒基于硅胶柱纯化方式。样品在裂解液(Buffer MTL)和蛋白酶作用下裂解消化,DNA释放到裂解液中。加入Buffer AL和乙醇后,转移至柱子中过滤,DNA被吸附上柱子的膜上,而蛋白质则不被吸附而随溶液滤出去除。柱子经Buffer GW1洗涤蛋白质和其它杂质,经Buffer GW2洗涤去除盐分,最后DNA被低盐缓冲液(Buffer AE)洗脱,洗脱的DNA可直接用于PCR、Southern blot、LAMP、Real-Time PCR等下游实验。

     DePure硅胶柱是采用高结合力的玻璃纤维滤膜为基质。滤膜在高浓度离子化剂(如盐酸胍或异硫氰酸胍)条件下,可通过氢键和静电等物理作用吸附核酸,而蛋白质或其它杂质不被吸附而去除。吸附了核酸的滤膜经洗涤去除蛋白质和盐,最后可以用低盐缓冲液(Buffer AE)洗脱出滤膜上吸附的核酸。得到的核酸纯度高,可直接用于各种下游实验。

 

三、 

DePure Tissue DNA Kit

产品编号

071041M

提取次数

48次

DePure gDNA Mini Columns

48个

2ml Collection Tubes

48个

Buffer MTL

40 ml

Buffer AL

40 ml

Buffer GW1

14 ml

Buffer GW2

20 ml

Proteinase K

24 mg

Protease Dissolve Buffer

32ml

RNase Solution

300 µl

Buffer AE

325ml

说明书

1

 

四、  

动物组织基因组DNA提取试剂盒除Proteinase K外,可在室温下(15-25℃)干燥保存12个月。长期保存时需置于2-8℃。低温下,Buffer MTL可能会有沉淀形成,需37℃水浴让沉淀完全溶解。Proteinase K干粉和RNase Solution室温运输,收到试剂盒后请保存于2~8℃或-20℃

 

五、        

  • 无水乙醇(96%-100%)
  • 灭菌的离心管和吸头
  • 小型离心机(13,000rpm)
  • 水浴锅或金属浴
  • 按瓶子标签所示,加入适量的Protease Dissolve Buffer至Proteinase K干粉中至终浓度为20mg/ml,颠倒混匀让蛋白酶K充分溶解,于-20℃保存。

071041M, 48次

加入1.2ml Protease Dissolve Buffer至Proteinase K管子中,颠倒混匀使蛋白酶K充分溶解,保存于-20℃。

  • Buffer GW1使用前,须按瓶子标签所示,加入无水乙醇进行稀释。

071041M, 48次

加入28 ml 无水乙醇

  • Buffer GW2使用前,须按瓶子标签所示,加入无水乙醇进行稀释。

071041M, 48次

加入80ml 无水乙醇

 

六、方案1. 动物组织DNA提取

    该方案适合于从1~20mg动物组织,如肝脏、脾脏、肾脏、老鼠尾巴等组织样品中提取DNA,以下离心操作都在室温进行。

  • 把1~20 mg组织样品(或10 mg肝脏、肺或脾脏)剪切成尽量小的碎片,并转移至1.5ml离心管中。加入230µl Buffer MTL和20µl Proteinase K,涡旋混匀。55℃水浴1~3小时或过夜消化样品。水浴期间需偶尔涡旋混匀,或放置于振荡水浴涡中。

注:适当的组织用量才能获得理想的提取结果,样品过多会降低产量和纯度。脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA,不宜超过10mg。肌肉和皮肤等样品用量可用到30mg以提高产量。将组织块尽量剪切成小碎片可缩短消化时间。采用液氮研磨,匀浆器处理组织样品可达到缩短消化时间的目的。小鼠尾巴最大用量为1.2cm,大鼠尾巴最大用量为0.6cm。消化时间取决于样品的类型和匀浆效果。一般组织样品需1-3小时,老鼠尾巴需6-8小时。过夜消化没有负面影响。

  • 加入5µl RNase Solution至消化液中混匀。室温或37℃水浴锅中放置15~60分钟降解RNA。

注:RNase Solution消化时间取决于样品类型。肝脏和肾脏富含RNA,需较长的消化时间。

  • (可选)10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的1.5ml离心管中。

注:若消化液比较浑浊或存在明显的颗粒,不要省略此步。

  • 加入250µl Buffer AL至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。70℃水浴10分钟。
  • 加入250µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。

注:处理肝脏或脾脏等组织时,加入乙醇时会有沉淀形成,属正常现象。用移液枪吸打10-15次尽量打散沉淀团。

  • 把DePure gDNA Mini Column装在2ml收集管中。转移第五步获得的混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

注:若柱子出现堵塞,延长离心时间。

  • 倒弃流出液,把柱子重新装回收集管中。加入500µl Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子上。10,000rpm离心1分钟。

注:Buffer GW1须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

  • 倒弃滤液,把柱子重新装回收集管中。加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

注:Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

  • 倒弃滤液,把柱子重新装回收集管中。再加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。
  • 倒弃流出液,把柱子重新装回收集管中。10,000 × g离心2分钟去除柱子中残留的乙醇。
  • 将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 rpm离心1分钟。
  • (可选)再加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 × g离心1分钟。

注: 处理DNA含量很低的样品无需第二次洗脱。

  • 丢弃DNA结合柱,DNA保存于2-8℃,长期保存需保存于-20℃。

 

七、方案2. 体液/细胞DNA提取

    该方案适合于从动物血液,血清,血浆,唾液等液体样品中直接提取DNA,以下离心操作都在室温进行。

  • 样品的处理
    • 红细胞带核的血液样品:鸟类/鱼类等非哺乳类动物血液的红细胞带细胞核,其DNA含量极为丰富。在1.5ml离心管中,加入1-10µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl,涡旋混匀,按第2步进行。
    • 红细胞不带核的血液样品:在1.5ml离心管中,1-200µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl,按第2步进行。
    • 唾液或其它液体样品:在1.5ml离心管中,加入1-200µl唾液或其它液体样品,用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl,按第2步进行。
    • 培养细胞(5 x 106):500 rpm离心收集细胞,倒弃培养液。加入200µl Buffer PBS或灭菌水涡旋重悬细胞。
  • 加入20µl Proteinase K至样品中,轻轻拍打几次混匀。
  • 加入200µl Buffer AL至样品中,最高速度涡旋混匀30秒。65℃水浴30分钟。

注:若需去除RNA,加入5ul RNase A至消化液中,室温静置15~30分钟。

  • 加入200µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。

注:若加入乙醇后有沉淀形成,用移液枪吸打5次打散沉淀团。

  • 按方案1的第6~13步进行操作。

 

八、     

该列表可能有利于您解决在提取过程中所碰到的问题。若您对试剂盒存在疑问或有良好的建议,又或者您在分子生物学实验中碰到问题,都请您联系我们。我们将竭尽所能为您排扰解难。

现 象

原 因

解 决 方 法

柱子堵塞

样品消化不充分

用液氮或匀浆器对样品进行研磨和匀浆,提高样品的消化效果。延长Proteinase K消化时间或过夜消化。

样品用量太多

减少样品用量。富含核酸的样品如肝脏,脾脏,肺脏等样品,组织用量不要超过10mg。

需要离心去除不消化物质

若样品消化后仍存在明显的颗粒,于10,000rpm离心5分钟去除末消化的物质。

用移液枪打散沉淀

加入乙醇后,消化液可能会有沉淀析出,用移液枪吸打尽量打散沉淀团。

Proteinase K活性下降

重新制备Proteinase K。分装保存Proteinase K,避免反复冻融,Proteinase K与Buffer AL不能预先混合。

DNA产量低

样品DNA含量低

组织样品本身含量低,用富含核酸的肝脏,脾脏来提取

柱子堵塞

参照上述情况

洗脱效率不够

增加洗脱体积和洗脱次数。由于基因组DNA片段大,水溶性较差。建议进行第三次洗脱以提高产量或提高洗脱液的体积。

Buffer GW1/GW2中乙醇没有加入或加入量不够

按说明书或瓶子标签所示,加入适量的无水乙醇至Buffer GW1和Buffer GW2中。

柱子没有空甩

柱子必须空甩2-3分钟以去除膜上残留的乙醇。

RNA污染

延长RNase消化时间

动物的内脏如肝脏和肾脏,以及培养细胞富含RNA,延长RNase消化时间至60分钟。

OD260/OD280比值不正常

RNA污染

加入RNase酶消化,或延长RNase酶的消化时间

Proteinase K活性下降

重新制备Proteinase K。使用后Proteinase K必须立即保存于-20℃。分装保存Proteinase K,避免反复冻融。

加入Buffer AL后混匀不充分

重新提取,加入Buffer AL后立即颠倒混匀3-5次,然后以最高速度涡旋让样品与Buffer AL充分混匀。

Buffer GW1/GW2中乙醇没有加入或加入量不够

按说明书或瓶子标签所示,加入正确的乙醇。

若以上的解答还是无法解决您的问题,请您联系我们。

 

九、企业信息

上海一基实业有限公司

电话:021-61119791

来源:上海一基实业有限公司
联系电话:021-61119791
E-mail:2851717098@qq.com

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